1 前言

自 2009年 9月起，澳大利亚政府强制规定将叶酸强化面粉用于面包加工产业，其中叶酸强化量为 2～3mg（叶酸）/kg(面粉)。实验室测定叶酸量的分析方法需在规定范围内检测并精确定量所添加的叶酸（成分）。实验室检测结果需与行业整体评估相一致且符合食品标准法则。此处描述的样品是按照能力验证(PT)研究样品的程序制备的，随后被用作内部质控样品。目前，已将其用于分析方法的开发并用来确保分析不同批次间结果的可比性。在样品制备过程中，商业叶酸的纯度和叶酸在混合容器壁上的吸附量是两个重要的问题。在本例中，制备此样品的同时即开发测定面粉中初始叶酸的分析方法。由于没有可靠的方法测定叶酸在样品中的均匀性，所以采用另一种测定方法。碳酸钡通常被用于证明(验证)在预期强化水平内混合工艺能否确保混合的均匀性。将碳酸钡（与预计叶酸相似的浓度）与不同面粉样品混合，此方法证明，一种固体如模拟替代叶酸的碳酸钡可以均匀的分布在面粉基质中。通过电感藕合等离子体质谱（ICPMS）分析面粉子样品中钡的含量，发现其按预期的浓度均匀分布在整个面粉中。因此，假定混合工艺能够以预期的浓度制备出均质样品，即该工艺是被验证过的。

当开发叶酸分析方法时，也将该工艺用于分析类似步骤制备的叶酸/面粉能力验证研究样品。但是（研究结果表明），虽然叶酸能够均匀分布在面粉中，但却不能达到预期浓度。最终，物料守恒实验表明，（部分）叶酸吸附在不锈钢混合容器的表面，这也是研究样品中叶酸浓度比预期的强化水平低的原因。实际上，叶酸是淡黄色的， 也使吸附结果更容易判定。进一步的实验表明，不锈钢容器可能最不适合用于混合叶 酸，聚丙烯容器可能是最好的选择。

2 样品描述和说明:2.1 叶酸强化白面粉，叶酸浓度 1.86mg/Kg。

3 制备: 质量控制样品品的制备步骤如图 C.1所示。

3.1 问题: 以下问题需要考虑：——用于强化面粉的商业化叶酸的纯度测定；——叶酸在混合容器表面的吸附；

——由于光敏性（文献）造成叶酸的降解；——基质（面粉）贮存过程中被昆虫（例如象鼻虫）污染而变质的危险；——用一种固体（粉末）强化另一种固体（粉末）；——粒度大小的均一性；——二次取样。

3.2 方法:下列方法用于解决上述问题：——用于强化面粉的商业叶酸的纯度：一瓶商业来源的叶酸其标签上标明叶酸含量为“约98%”，但并未明确此含量为质量分数还是摩尔分数。生产商的“分析证书”标明此产品含有 8%的水分，这表明“约 98%”是指叶酸在有机组分（即叶酸和相似结构的杂质）中的纯度，而不是叶酸在所谓纯物质中的总纯度。在这种情况下，内部纯度评估（定量核磁共振，热重分析和费歇尔滴定法）可用于确定叶酸的总纯度。也可用不同供应商提供的的商业化叶酸进行标准比对。——光敏性：在箔纸包盖或其他遮光的容器内进行样品制备。——降低由昆虫引起的基质（面粉）变质风险：将最终产品放置在-80℃环境中过夜存放，以杀死任何可能存在的昆虫幼虫。——用一种固体（粉末）强化另一种固体（粉末）：均匀混合筛滤后的叶酸和白面粉，使用重量分析法制备浓缩的预混料。将适量的预混料与筛滤后的空白面粉均匀混合，制备出终产品。为了确保均匀性，混合过程应分阶段完成。约 200 g 的未强化面粉中加入（适量的）浓缩面粉预混料后，混合物在迷你搅拌机中反复滚动以达到混合均匀的目的。每 2 h 加入约 200 g 的未强化面粉至混合物中直至达到预期浓度。——混合容器表面的吸附：通过重复分析法得出的（采用上述工艺制备的）强化面粉中叶酸浓度低于预期的重量分析结果。随后采用严格的物料守恒方法，通过分析叶酸强化面粉样品制备各阶段中空容器壁的洗出液，来确定制备过程中吸附在各混合容器表面的叶酸量。测试不同材质的容器（有机玻璃、金属、聚丙烯）是否可以减少对样品的吸附量，但并不能避免吸附的问题。因此，重量分析设防水平并不能用于分配叶酸在面粉中的重量分数。——粒度的均一性：混合前的面粉和叶酸都要用 180μm 的筛子过滤。——二次抽样：叶酸强化的材料通过 Retsch PT100 旋转分装器分为 50g 一份。注：Retsch PT100 旋转分装器是一种适合的商品化的产品。给出这个信息是为 了方便用户使用本文件，此产品并非由 ISO指定。

4 分包和包装（例如任何污染问题，选择性蒸发，特殊的密封要求）

4.1 问题:以下问题需要考虑：——容器的吸附；——光敏性。

4.2 方法:以上问题可如下处理：

——使用有聚乙烯螺帽的容器以减少吸附量，且便于样品材料的取用；

——建议室温避光保存。

5 均匀性

5.1 均匀性实现和确认

通过浓缩预混料的连续稀释和完全混匀实现均匀性（见C.3.2）。

数据分析显示在制备均质样品过程中，样品含有预期的钡（重量）浓度。

测试方法中使用碳酸钡是假定叶酸和碳酸钡在混合样品制备过程中有相似的表现。但在制备过程中发现叶酸会吸附在混合容器的容器壁上，因此假设是不成立的（见以上讨论）。

在后续面粉中叶酸的能力验证研究过程中多次检测了此方法制备出的样品的均匀性。在这些研究中，通过分析7³1 g 一式两份的叶酸子样品来确定样本的均匀性。

（具体方法是）采用精确匹配的同位素稀释液（处理样品后），通过液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）在选定的反应模式下检测得出（样品中的）叶酸质量分数。

本方法还采用方差分析（ANOVA）确定了瓶内（分析）和瓶间的方差。

5.2 数据和数据处理的实例:在没有适用的叶酸分析方法的前提下制备了内部质量控制样品（参见前面关于讨论使用碳酸钡均匀性的重新验证）。以下提供的数据是通过研究一种类似的能力验证研究材料、用类似浓度、按描述的步骤强化得到的，用于确定叶酸强化小麦面粉质控.材料的同质性（参见图C.2）。

为了进一步指导如何计算瓶间非均匀性，两种情况下可能使用方差分析。如果组间均方比组内均方大，那么瓶间方差即为组内均方减组间均方，再除以每个单元做的平行测量次数(案例 2)。瓶间标准偏差是这个瓶间方差的平方根，如 9.3所示。如果组间均方比组内均方小，则瓶间非均匀性按照案例 4计算。详解参见 ISO Guide 35。5.3 稳定性实现和确认:首先，叶酸的稳定性是基于文献而假定的。面粉的稳定性也是一个关注点，这可以通过在-80℃处理最终样品来解决。样品的稳定性，通过分析一段时期内多批量样品，未观察到任何变化趋势（即为稳定性好）。

6 贮藏和处理:室温下，干燥环境避光贮藏。室温贮藏是基于先前文献的假设并通过实践证明了其可行性。基于均匀性测试要求，最小样品量为 1g。安全提示：无毒，仅供实验室使用，禁止食用。

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